如何創(chuàng)建令人驚嘆的細(xì)胞球體3D圖像

　　第一部分：µ-Slide球體灌注中的球體形成和培養(yǎng)

　　請在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前閱讀指示。所有步驟均需在無菌條件下執(zhí)行。

　　開始實驗之前，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶（例如 T75）中制備 L929 成纖維細(xì)胞，細(xì)胞粘附在底部。細(xì)胞在實驗當(dāng)天應(yīng)該是健康的并且*佳亞匯合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡所有必需的材料，例如載玻片、培養(yǎng)基和管道（灌注套件）。平衡對于防止氣泡隨著時間的推移而出現(xiàn)至關(guān)重要。

　　1. 將60 µl 無細(xì)胞培養(yǎng)基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每個通道（根據(jù)說明用提供的蓋玻片封閉）　　

　　2. 在培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 2 小時。孵育期間始終關(guān)閉蓋子。　　

　　3. 用 Accutase 處理培養(yǎng)的 L929 細(xì)胞 1-2 分鐘以使其脫離。　　

　　4. 收集細(xì)胞懸液，離心，在培養(yǎng)基中稀釋；量取決于所需的細(xì)胞濃度。　　

　　5. 對細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整至終濃度為 5 x 105cells/ml。　

　　6. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗 µ-Slide 球體灌注的通道，以去除潛在的氣泡。　　

　　7. 將 45 µl 細(xì)胞懸液直接移入每個通道。　　

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小時，使細(xì)胞在壁孔中沉淀。　　

　　9. 用60 µl 無細(xì)胞培養(yǎng)基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的儲液庫。　　

　　10. 在 37°C 下孵育過夜以形成球體。　　

　　11. 檢查通道是否有氣泡。如果通道中存在任何氣泡，請用無細(xì)胞培養(yǎng)基小心沖洗通道。　　

　　12. 使用ibidi 串行連接器連接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 個通道　　

　　13. 根據(jù)ibidi 泵系統(tǒng)、流體單元和灌注裝置指示。　　

　　14. 將µ-Slide 球體灌注連接到 ibidi 泵系統(tǒng)并開始流動。使用盡可能低的流速（5 mBar 氣壓導(dǎo)致流速為 0.74 ml/min）。進(jìn)行實驗，直到球體具有所需的成熟狀態(tài)，在這種條件下培養(yǎng) 7 天后。　　

　　圖1：L929 成纖維細(xì)胞在孔中形成球體并在流動條件下培養(yǎng)

　　圖 2：L929 成纖維細(xì)胞在µ-Slide 球體灌注中顯示球體形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系統(tǒng)灌注，0.74 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，井徑 800 µm。

　　第二部分：L929 球體的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中進(jìn)行。在開始染色之前，請閱讀指示并遵循載玻片中關(guān)于一般移液和更換溶液的建議。

　　1. 當(dāng) L929 球體培養(yǎng)達(dá)到所需的成熟狀態(tài)（此處為 7 天后）時，小心地斷開 µ-Slide球體灌注與 ibidi 泵系統(tǒng)的連接。　　

　　2. 在 RT 處用冷 IC 固定緩沖液固定球體 10 分鐘。　　

　　3. 在 RT 中將球體封閉和染色緩沖液中孵育 1 小時。　　

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球體過夜。從這一點開始，保持載玻片避光。圖 3A 顯示了清除前的球體成像。　　

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗細(xì)胞一次。　　

　　6. 通過在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的異丙醇稀釋液孵育15 分鐘，依次使球體脫水。　　

　　7.  在冰上用純異丙醇孵育球體兩次 15 分鐘。　　

　　8.  從冰中取出載玻片，讓它升溫至 RT。　　

　　9.  執(zhí)行清除：在 RT 處用純 ECi 灌注兩次。在這個階段，球體可以避光儲存數(shù)周，而不會顯著損失熒光。　　

　　10.  使用共聚焦顯微鏡的圖像球體（參見圖 3）。　　

　　圖 3：清除前后染色 L929 球體的共聚焦顯微鏡（紅色：鬼筆環(huán)肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球體。請注意，由于光散射和吸收，只能看到外圍細(xì)胞，而看不到中心的細(xì)胞。(B, C) 清除后的球體。請注意，清洗前后的尺寸差異源于脫水和清洗過程，同一位置的橫截面。(B) 橫截面 (C) 體積/3D 視圖。球體的清除允許即使在球體成纖維細(xì)胞的中心也可以看到細(xì)胞，同時保留球體的形態(tài)。細(xì)胞核的計數(shù)甚至可以確定形成該球體的細(xì)胞數(shù)。

　　注：此實驗方案來自ibidi的實際用戶，更多詳情可聯(lián)系本文作者　　

　　僅供科研使用！